新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)與Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)比較

【摘要】目的應(yīng)用物體識(shí)別方法研究D2半乳糖長(zhǎng)期注射致腦老化小鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力,并比較物體識(shí)別方法與Morris 水迷宮方法對(duì)該模型測(cè)試的靈敏性。方法C57BL/ 6 小鼠,隨機(jī)分成正常對(duì)照組、D2半乳糖低劑量組(50mg/ kg ,sc) 、D2半乳糖高劑量組(100mg/ kg ,sc) ,連續(xù)造模8 周。以物體識(shí)別方法和Morris 水迷宮方法測(cè)試各組動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果在物體識(shí)別測(cè)試中, D2半乳糖高劑量組分辨指數(shù)(15. 71 ±3. 94) 較對(duì)照組(45. 89 ±7. 41) 減低具有非常顯著性意義( P < 0. 001) ,低劑量分辨指數(shù)(24. 69 ±6. 25) 與對(duì)照組的差異也存在顯著性意義( P < 0. 05) 。在Morris 水迷宮測(cè)試中,D2半乳糖高劑量組動(dòng)物逃逸潛伏期比對(duì)照組延長(zhǎng)有顯著性意義( P < 0. 01) ;高劑量組在目標(biāo)象限空間探索所停留時(shí)間與游泳距離比均較正常對(duì)照組減少有顯著性意義( P < 0. 05) 。結(jié)論D2半乳糖可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)顯著的物體識(shí)別能力障礙,用物體識(shí)別測(cè)試方法比Morris 水迷宮方法更靈敏地反映該模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。

【關(guān)鍵詞】D2半乳糖; 學(xué)習(xí)記憶; 物體識(shí)別; 水迷宮; 腦老化

一、實(shí)驗(yàn)概述

物體識(shí)別測(cè)試(Object Recognition Test) 是利用動(dòng)物先天對(duì)新物體有探索傾向的原理而建立的學(xué)習(xí)記憶測(cè)試方法。該方法具有讓鼠在自由活動(dòng)狀態(tài)下進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶測(cè)試的特點(diǎn),能更近似地模擬人類的學(xué)習(xí)記憶行為。本研究擬應(yīng)用物體識(shí)別方法研究D2半乳糖長(zhǎng)期注射致腦老化小鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力,并與水迷宮行為學(xué)測(cè)試相比較,為促進(jìn)物體識(shí)別測(cè)試方法在我

國(guó)學(xué)術(shù)界的應(yīng)用提供借鑒材料。

因C57BL/ 6 近交系小鼠已被證明有良好物體識(shí)別與空間記憶能力, 以及隨衰老而記憶力減退規(guī)律,本實(shí)驗(yàn)選用C57BL/ 6 小鼠,3 月齡,雌性,體質(zhì)量(20 ±2) g ,購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心(許可證號(hào):SCXK(京) 200220001) ,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,隨機(jī)分成正常對(duì)照組、D2半乳糖低劑量組、D2半乳糖高劑量組。小鼠均在無特殊致病原(SPF) 級(jí)動(dòng)物室飼養(yǎng)至行為學(xué)測(cè)試前。低劑量組每日于背部皮下注射D2半乳糖(購(gòu)自Sigma 公司, G5388) 50mg/ kg ,高劑量組每日皮下注射D2半乳糖100mg/ kg ,對(duì)照組注射等量生理鹽水,連續(xù)8 周。

二、行為學(xué)測(cè)試

1. 物體識(shí)別試驗(yàn): 造模8 周后, 參考Ennaceur等方法進(jìn)行物體識(shí)別試驗(yàn),裝置主要由一個(gè)測(cè)試盒(自制) 與2 套(每套2 只) 測(cè)試物體組成,測(cè)試物體在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)篩選有近似的小鼠喜好程度。本實(shí)驗(yàn)測(cè)試盒以45cm ×35cm ×20 cm 的乳白色硬塑料方盒自制而成。（備注：物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可以選購(gòu)上海欣軟公司研發(fā)的SuperMaze軟件，型號(hào)為XR-XX117），物體A 套為藍(lán)色方形硬塑兒童玩具,約4. 5cm ×4. 5cm ×5 cm ,B 為白色圓柱形塑料盒,底面直徑4cm ,高7cm ,兩物體均足夠重以防止小鼠推動(dòng)。測(cè)試環(huán)境要求在隔音、避光的場(chǎng)所。在測(cè)試盒上方以60W 白光燈照射使盒內(nèi)無陰影處。

測(cè)試主要分適應(yīng)期、熟悉期和識(shí)別期：

第1 天為適應(yīng)期:在上述條件下,將鼠放入測(cè)試盒的中間,盒內(nèi)未放任何物體,讓其自行適應(yīng)性活動(dòng)10min。

第2 天為熟悉期: 在測(cè)試盒中放入2 個(gè)相同的玩具(AA 或BB) ,距離長(zhǎng)軸(45cm) 兩側(cè)壁8cm ,將鼠從盒中距物體等距離處放入。測(cè)試者兩手各握1 只秒表(上海秒表廠) ,每只秒表對(duì)著1 個(gè)動(dòng)物,開始紀(jì)錄其在每個(gè)物體上的探索時(shí)間(以鼠嘴湊近物體約2cm 范圍內(nèi)計(jì)時(shí),鼠爬在玩具上玩或者只是在物體附近走則能計(jì)入) ,以秒表間斷累積計(jì)時(shí)測(cè)定鼠探索每個(gè)物體的時(shí)間總和,為在第3 天的計(jì)時(shí)提供練習(xí)。

第3 天為識(shí)別測(cè)試期:將另外一套中的一個(gè)物體替換前**中的一個(gè)玩具放入盒內(nèi)(AB 或BA) ,將鼠放在盒中距兩物體等距離處10min。每只鼠測(cè)試完成后,用酒精擦拭物體以消除鼠停留在物體上的氣味,并且按次序輪流調(diào)換各物體在盒內(nèi)的位置,以消除鼠對(duì)物體在盒內(nèi)位置喜好程度不同而帶來的影響。為進(jìn)一步減少兩種物體本身差異對(duì)鼠探索時(shí)間比較的影響,本實(shí)驗(yàn)以兩位測(cè)試者在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用兩個(gè)相同裝置測(cè)試每組的一半動(dòng)物,但兩裝置中的物體

相對(duì)應(yīng)鼠的新舊次序相反(如A 在一測(cè)試者為新物體在另一測(cè)試者則為舊物體) 。鼠的物體識(shí)別能力以第3 天探索新舊物體的時(shí)間,并以探索時(shí)間計(jì)算分辨指數(shù)(discrimination index ,DI) 來評(píng)價(jià)。分辨指數(shù)計(jì)算公式為:DI = (N-F) / (N + F) ×100 % ,式中N 為在探索新物體所用的時(shí)間,F 為探索舊物體所用的時(shí)間。

2. Morris 水迷宮:由4d 的訓(xùn)練期和第5天的空間探索試驗(yàn)組成,見參考文獻(xiàn)。

三、統(tǒng)計(jì)方法

各組動(dòng)物在物體識(shí)別試驗(yàn)的新舊物體探索時(shí)間、分辨指數(shù)和在水迷宮空間探索中在目標(biāo)象限所停留時(shí)間與距離比以單因素方差分析結(jié)合Post Hoc2Duncan法進(jìn)行組間比較分析;4d Morris 水迷宮中的逃逸潛伏期(從入水到找到站臺(tái)的時(shí)間) 以重復(fù)測(cè)量的雙因素方差分析進(jìn)行比較分析。數(shù)據(jù)以x ±s 表示。

四、討論

D2半乳糖長(zhǎng)期皮下注射可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)顯著的物體識(shí)別記憶能力障礙。而且用物體識(shí)別測(cè)試方法比Morris 水迷宮方法更靈敏地反映該模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。鼠的物體識(shí)別能力與海馬、基底前腦和嗅周皮層等腦區(qū)功能有關(guān),受自由基損傷以及腦內(nèi)單胺遞質(zhì)含量等因素影響。Morris水迷宮測(cè)試的空間學(xué)習(xí)記憶能力與海馬、紋狀體、基底前腦、小腦等腦功能區(qū)域有關(guān)。D半乳糖可造成鼠腦皮層與海馬自由基損傷、腦內(nèi)單胺遞質(zhì)含量減少,可能是導(dǎo)致其物體識(shí)別以及空間學(xué)習(xí)記憶能力減低的原因。

Luparini 等發(fā)現(xiàn)在物體識(shí)別測(cè)試中出現(xiàn)的老年鼠輕度記憶損害現(xiàn)象在Morris 水迷宮測(cè)試中消失,與我們的研究結(jié)果類似。造成這兩種學(xué)習(xí)記憶測(cè)試方法敏感性不同的可能原因有二: ①鼠的精神狀態(tài)。在物體識(shí)別測(cè)試中,鼠始終處于自主活動(dòng)的狀態(tài),是在日常精神穩(wěn)定狀態(tài)下進(jìn)行的測(cè)試;而在水迷宮中,鼠去找平臺(tái)是在害怕沉水的應(yīng)激下進(jìn)行,應(yīng)激本身可導(dǎo)致學(xué)

習(xí)記憶能力下降。②兩種行為測(cè)試方法所依賴的腦功能區(qū)域不同。近年來的研究證據(jù)表明,物體識(shí)別與嗅皮質(zhì)或嗅周皮質(zhì)有高度相關(guān),如細(xì)胞毒性造成大鼠的嗅皮質(zhì)損傷只造成物體識(shí)別能力損害而空間記憶保持 ,而空間學(xué)習(xí)記憶能力似乎比物體識(shí)別記憶更依賴于海馬功能,如海馬CA3 區(qū)域的部分損傷以及后海馬的神經(jīng)毒性損傷可導(dǎo)致Morris 水迷宮空間識(shí)別障礙而無物體識(shí)別能力的損傷表現(xiàn),D2半乳糖致腦老化鼠在嗅周皮質(zhì)的損傷是否比在海馬區(qū)損傷嚴(yán)重值得進(jìn)一步研究。

我們應(yīng)用物體識(shí)別測(cè)試方法的體會(huì)主要有: ①在測(cè)試盒內(nèi)光線要充足,不能留有陰暗處或裂縫; ②測(cè)試物體在要實(shí)驗(yàn)前作鼠喜好性篩選,并且足夠大以引起鼠的注意; ③測(cè)試者在測(cè)試第2 天需訓(xùn)練秒表間斷連續(xù)計(jì)時(shí)法以使第3 天能熟練計(jì)時(shí); ④測(cè)試過程中更換兩物體在測(cè)試盒內(nèi)的位置,并只在鼠探索物體時(shí)才計(jì)時(shí); ⑤該法測(cè)試時(shí)間相對(duì)長(zhǎng),在需測(cè)動(dòng)物數(shù)較多時(shí)可以兩人同時(shí)進(jìn)行。總之,物體識(shí)別測(cè)試方法簡(jiǎn)便、靈敏,適合學(xué)習(xí)記憶功能障礙的機(jī)理及**學(xué)研究。新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)與Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)比較

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