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【關(guān)鍵詞】： 高架十字迷宮   曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)   懸吊實(shí)驗(yàn)

　　肖獻(xiàn)忠等構(gòu)建  H SF1 基 因 缺 陷 的 小 鼠 模型[ 4 ],為研究 HSP s提供了好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型 。 San2t o s等發(fā)現(xiàn) HSF1 基因缺陷小鼠的大腦出現(xiàn)了形態(tài)學(xué)改變 ,鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其大腦的室周組織中出現(xiàn)細(xì)胞空泡化 、 胞內(nèi)出現(xiàn)無(wú)結(jié)構(gòu)聚集物 、 核固縮等現(xiàn)象 ,這種改變表現(xiàn)為基因累積效應(yīng)。但這些腦部結(jié)構(gòu)的改變是否對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能產(chǎn)生影響及其影響程度 ,至今尚不清楚 。 很多研究表明 ,某些有重要生理功能的單個(gè)基因被敲除后 , 基因缺陷動(dòng)物的行為會(huì)出現(xiàn)一系列的改變 , 如 L ahde s m ak i發(fā)現(xiàn)腎上腺受體 α2 基因缺陷的小鼠表現(xiàn)出豎毛行為增加 ,運(yùn)動(dòng)能力受損 ,焦慮行為增多以及晝夜節(jié)律的改變。B u r ne發(fā)現(xiàn)維生素 D 受體基因缺陷小鼠的運(yùn)動(dòng)功能明顯受損 , 但對(duì)于小鼠的認(rèn)知功能不造成影響 。HSF1基因在個(gè)體的應(yīng)激反應(yīng)中有著重要生理功能 ,HSF1基因缺陷也可能會(huì)導(dǎo)致個(gè)體出現(xiàn)很多的行為改變 。 我們?cè)趯?duì) H SF1在應(yīng)激中的作用的研究過(guò)程中 ,觀察到 H SF1 基因缺陷小鼠在飼養(yǎng)籠內(nèi)的自發(fā)性活動(dòng)減少 ,除了自發(fā)活動(dòng)改變外 ,是否還存在其它方面的行為改變 ? 這些行為改變的原因是什么？為對(duì)這些問(wèn)題作進(jìn)一步的了解 , 本研究采用多種行為觀察方法從情緒性 、探索行為 、工作記憶能力以及運(yùn)動(dòng)能力四個(gè)方面對(duì) H SF1 基因缺陷小鼠的行為進(jìn)行評(píng)估 ,以探討 H SF1 對(duì)小鼠大腦功能的影響 ,為進(jìn)一步的研究提供基礎(chǔ) 。

2 　 材料與方法

2 . 1 　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

24 ～28 周齡雄性 H SF1 基因敲除小鼠 39 只( HSF1 - / - ) ,野生型小鼠 36 只 ( HSF1 + / + ) 。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從美國(guó)德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心引進(jìn)[ 4 ],由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖 。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)基因缺陷小鼠的行為改變影響　

2 . 3 　 行為觀察指標(biāo)

　　 所有的動(dòng)物均在上午 9 點(diǎn)開(kāi)始依次進(jìn)行以下 7項(xiàng)行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn) , 完成一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)后放回原來(lái)的籠中休息 20 m i n 。 所有實(shí)驗(yàn)均由兩名熟練掌握行為測(cè)驗(yàn)方法的實(shí)驗(yàn)人員共同進(jìn)行評(píng)定 。

2 . 3 . 1 　 情緒性水平評(píng)定 　 

參照 A de r等的方法[ 8 ],按照吳大興等編制的中國(guó)地鼠情緒性水平評(píng)定量表進(jìn)行評(píng)定。具體方法如下 : 打開(kāi)籠箱 , 用鑷子夾住小鼠尾巴 , 以是否困難來(lái)評(píng)定取出難易 , 1 ～2 次抓住 ,認(rèn)為較易 ,記為 0分 ; 3～4次認(rèn)為困難 ,記為 1分 ; 大于等于 5 次認(rèn)為極困難記為 2 分 。夾住尾巴后 ,頭朝下 ,力度以鼠不掉地為準(zhǔn) ,然后觀察 30 s, 以評(píng)定掙扎程度 、 發(fā)聲 、 排便 ; 掙扎程度以鼠四肢不動(dòng)或輕微掙扎記 0 分 ; 四肢掙扎 , 背部彎曲 , 頭朝上但未達(dá)到尾部記 1 分 ; 劇烈掙扎 ,翻身至尾部或者嘶咬鑷子記 2分 ; 發(fā)聲程度以被夾住后無(wú)叫聲或 1 ～4 次嘰嘰叫 ,間隔時(shí)間長(zhǎng)記 0 分 ; 5 ～10 次尖叫記 1 分 ;大于等于 10 次尖叫 , 急促 , 記 2 分 ; 自發(fā)性排尿 , 以無(wú)排尿記 0分 ; 有排尿記 1 分 ; 自發(fā)性排便 , 以無(wú)排便記 0分 ; 有排便記 1 分 ,將五項(xiàng)得分相加得出情緒性水平的總分 ,范圍為 0～8 分 。

2 . 3 . 2 　 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 　 

用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定動(dòng)物的情緒喚醒度[ 10 ]。實(shí)驗(yàn)裝置為一木制黑色高架十字迷宮 。 迷宮包括兩條開(kāi)放臂 ( 50 c m ×10 c m )和兩條閉合臂 ( 50 c m × 10 c m × 40 c m ) ,由中央?yún)^(qū) ( 10 × 10 c m ) 聯(lián)結(jié) , 迷宮放置在 50 c m 的高架上 。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)把動(dòng)物面朝閉臂放置 ,觀察 5 m i n活動(dòng)情況 。 觀察指標(biāo)為 : 開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)和時(shí)間 ,閉臂進(jìn)入次數(shù)和時(shí)間 。 計(jì)算入臂次數(shù) 、 開(kāi)臂次數(shù)在總?cè)氡鄞螖?shù)中的比率 。

2 . 3 . 3 　 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 　 

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是一個(gè)經(jīng)典的行為學(xué)實(shí)驗(yàn) ,能很好的評(píng)定動(dòng)物的情緒性水平以及在開(kāi)放的陌生環(huán)境中的探索行為[ 11 ]。實(shí)驗(yàn)裝置為木制曠場(chǎng) ( 100 c m × 100 c m × 30 c m ) , 底部用筆劃分成 25 個(gè)20 c m × 20 c m 方格 ,沿墻格稱為周圍格 , 其余為中央格 ,將動(dòng)物放置在中央格 , 觀察 5 m i n 內(nèi)活動(dòng)情況 。觀察指標(biāo)為 : 中央格爬行次數(shù) , 周圍格爬行次數(shù) , 爬行總格數(shù) 。

2 . 3 . 4 　 簡(jiǎn)易迷津?qū)嶒?yàn) 　 

該實(shí)驗(yàn)反映動(dòng)物在較為封閉的環(huán)境中的自發(fā)探索行為[ 12 ]。簡(jiǎn)易迷津箱為一120 c m × 20 c m × 20 c m 木箱 , 以木板間隔成 8 格 , 隔板下方有容納小鼠通過(guò)的小洞 , 左中右隨機(jī)排列 。木箱分為起始端和目的端 。 實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠放于起始端的方格內(nèi) , 觀察 5 m i n 動(dòng)物活動(dòng)情況 。觀察指標(biāo)為 : 5 m i n爬行總格數(shù) 。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)基因缺陷小鼠的行為改變影響

2 . 3 . 5 　T2 CAT 實(shí)驗(yàn) 　

Ge rl a i發(fā)明的 T - C A T方案基于動(dòng)物探新的本能 , 能很好地測(cè)量出動(dòng)物的探索動(dòng)機(jī)和工作記憶能力。 T - C A T包括兩條臂 — — —起始臂 ( 直臂 ) 和目的臂 ( 橫臂 ) , 均為 75 c m × 12 c m× 20 c m ,兩臂交叉呈 T型 ,起始臂的末端 24 c m 處通過(guò)活動(dòng)門隔出一個(gè)起始區(qū) 。 目的臂的兩個(gè)入口處也有活動(dòng)門 。 整個(gè)實(shí)驗(yàn)包括 1 次被動(dòng)選擇測(cè)驗(yàn)和 14次主動(dòng)選擇測(cè)驗(yàn) 。**次為被動(dòng)選擇測(cè)驗(yàn) , 目的臂一端入口的活動(dòng)門關(guān)閉 , 動(dòng)物只能探索目的臂的一端 ,當(dāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物探索完目的臂并自行回到起始臂后 ,把起始臂的活動(dòng)門關(guān)閉 ,動(dòng)物在起始區(qū)內(nèi)待 5 s 。從**次開(kāi)始連續(xù)進(jìn)行 14 次主動(dòng)選擇測(cè)驗(yàn) 。同時(shí)打開(kāi)兩個(gè)活動(dòng)門 ,動(dòng)物開(kāi)始探索目的臂 ,當(dāng)動(dòng)物進(jìn)入其中一端時(shí) ,關(guān)上另一端的活動(dòng)門 。當(dāng)動(dòng)物完成探索回到起始臂后 ,關(guān)上起始臂的活動(dòng)門 ,讓動(dòng)物在起始臂內(nèi)待 5 s,完成一次探索 。隨后的 2 ～14 次探索均按以上程序進(jìn)行 。由于老鼠具有探新的本能 , 因此每次探索會(huì)傾向于進(jìn)入上次探索未去的目的臂 。 記錄 14次主動(dòng)選擇測(cè)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)換次數(shù) , 以及完成 15次選擇所花時(shí)間 。

2 . 3 . 6 　 獨(dú)木橋通過(guò)實(shí)驗(yàn) 　 

采用獨(dú)木橋通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)定動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)平衡能力 。 實(shí)驗(yàn)裝置為一個(gè)木制獨(dú)木橋 ( 100 c m × 1 c m ) , 分為起始端和目的端 , 目的端有一 小 平 臺(tái) ( 10 c m ×10 c m )[ 14 ]。獨(dú) 木 橋 放 置 在30 c m 的高處 。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)讓小鼠在平臺(tái)上適 應(yīng)5 m i n后把小鼠放置在獨(dú)木橋的起始端 ,記錄動(dòng)物到達(dá)目的平臺(tái)的時(shí)間 , 實(shí)驗(yàn)限時(shí) 1 m i n, 如果未完成或者從獨(dú)木橋上跌下均算失敗 , 時(shí)間記為 60 s 。每只小鼠連續(xù)進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn) , 計(jì)算小鼠到達(dá)平臺(tái)三次的平均時(shí)間 ,每次試驗(yàn)間隔 1 m i n 。

2 . 3 . 7 　 懸掛實(shí)驗(yàn) 　 

采用懸掛試驗(yàn)來(lái)評(píng)定動(dòng)物的四肢肌力和運(yùn)動(dòng)平衡能力 。懸掛實(shí)驗(yàn)的器材為一根1 m 長(zhǎng)的鐵絲 ( 直徑 2 mm ) , 平行置于離地 50 c m 處 ,鐵絲的一端有一個(gè)逃生的入口[ 15 ]。實(shí)驗(yàn)時(shí)讓小鼠前肢抓緊鐵絲的一端 ,每次實(shí)驗(yàn) 3 m i n,共進(jìn)行 3 次 ,每次實(shí)驗(yàn)之間間隔 30 s 。 如果小鼠能在鐵絲上懸掛3 m i n或者能移動(dòng)到逃生入口算作實(shí)驗(yàn)成功 , 記為 1分 ; 如果 3 m i n內(nèi)從鐵絲上掉下算實(shí)驗(yàn)失敗 , 記為 0分 。 計(jì)算小鼠三次懸掛實(shí)驗(yàn)的總分 。

2 . 4 　 數(shù)據(jù)處理

　　 所有數(shù)據(jù)都采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn) , 差異顯著性設(shè)為 p < 0 . 05 ,所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均在 Supermaze動(dòng)物行為學(xué)分析軟件包上完成 。

總結(jié)：

為研究HSF1基因缺陷小鼠的行為特征,探索HSF1基因在小鼠行為表現(xiàn)中的作用。選取6~7個(gè)月大雄性HSF1基因缺陷小鼠39只及野生型小鼠36只進(jìn)行情緒性評(píng)分、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、簡(jiǎn)易迷津?qū)嶒?yàn)、T-CAT實(shí)驗(yàn)、獨(dú)木橋?qū)嶒?yàn)和懸掛實(shí)驗(yàn)以觀察其情緒性喚醒水平、焦慮水平、探索行為、工作記憶能力和運(yùn)動(dòng)能力。結(jié)果表明HSF1基因缺陷小鼠的情緒喚醒水平和焦慮水平較低、探索行為減少、T-CAT中轉(zhuǎn)換率較低,提示小鼠的情緒、探索動(dòng)機(jī)和工作記憶受HSF1基因的調(diào)控。