［摘要］ 目的: 優(yōu)選三七葉總皂苷的酶解工藝并評價(jià)其酶解產(chǎn)物的抗抑郁活性。方法: 以人參皂苷類成分的轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)選三七葉總皂苷的酶解工藝。建立小鼠慢性溫和性不可預(yù)知應(yīng)激模型評價(jià)酶解產(chǎn)物的抗抑郁活性。結(jié)果: 選擇蝸牛酶為轉(zhuǎn)化酶，酶解 pH 4. 5，溫度 50 ℃，時(shí)間 12 h，人參皂苷類成分的轉(zhuǎn)化率達(dá) 50%。小鼠建模 6 周后，呈現(xiàn)出體重下降、快感缺失、行動(dòng)遲緩等抑郁癥相似行為，表明建模成功。第 7 ～9 周給藥期內(nèi)給藥組小鼠體重及糖水偏好率顯著增加，自主活動(dòng)水平亦有一定程度的改善。第 9 周時(shí)與模型組相比，酶解產(chǎn)物不同( 低、中、高) 劑量組、氟西汀組小鼠的體重分別增加了 9. 33%，12. 44%，18. 13%，15. 03%; 糖水偏好率分別提高了 22. 64%，19. 87%，19. 38%，20. 85%; 自主活動(dòng)水平分別提高了 8. 35%，41. 30%，13. 33%，12. 06%，其中酶解產(chǎn)物中劑量組呈現(xiàn)極顯著性差異。結(jié)論: 三七葉總皂苷酶解產(chǎn)物對抑郁小鼠模型具有良好的抗抑郁作用。

［關(guān)鍵詞］ 三七葉總皂苷; 人參皂苷類成分; 酶解產(chǎn)物; 慢性溫和性不可預(yù)知應(yīng)激模型; 抑郁癥; 單因素試驗(yàn)

三 七 葉 總 皂 苷 為 五 加 科 植 物 三 七 Panaxnotoginseng ( Burk． ) F． H． Chen 葉子的提取物，為傳統(tǒng)中成藥七葉神安片的主要原料，具有****、**止痛的功效。文獻(xiàn)報(bào)道人參總皂苷具有明顯的抗抑郁作用，其有效成分包括人參皂苷Ｒb1和人參皂苷 C-K，前期研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷 Ｒb3亦具有顯著的抗抑郁活性。由于人參皂苷 Ｒb1，Ｒb3均為三七葉總皂苷的主要成分，故推測三七葉總皂苷具有抗抑郁活性。研究表明人參皂苷類成分會(huì)在動(dòng)物胃腸液及腸內(nèi)菌的作用下產(chǎn)生系列代謝產(chǎn)物而發(fā)揮藥理藥效作用，體外研究表明酶解法可適當(dāng)降解三七葉總皂苷而獲得較多的次級皂苷或者皂苷元，故推測三七葉總皂苷的體外酶解產(chǎn)物具有較好的抗抑郁作用。本實(shí)驗(yàn)擬制備三七葉總皂苷的酶解物，采用小鼠慢性溫和性不可預(yù)知應(yīng)激模型初步評價(jià)其抗抑郁活性，為基于三七葉總皂苷為原料的抗抑郁新藥的開發(fā)提供參考。自發(fā)活動(dòng)曠場實(shí)驗(yàn)抗抑郁活性評價(jià)

1 材料

LC-10A 型高效液相色譜儀 ( 日本島津公司) ，202A1 型數(shù)顯電熱恒溫干燥箱( 上海錦屏儀器儀表公司) ，XR-XZ301型自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)裝置及視頻分析系統(tǒng)( 上海欣軟信息科技有限公司) 。三七葉總皂苷( 廣東環(huán)球制藥有限公司) ，人參皂苷 Ｒb1，Ｒb2，Ｒb3對照品( 均購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為 110704-200318，111715-200802，111686-200501) ，人參皂苷 C-K，Ｒh2，Ｒc 及原人參二醇對照品( 均購自南京澤朗醫(yī)藥有限公司，批號分別為39262-14-1-100312，78214-33-22000103，11021-14-0-100507，7755-01-3-100414) ，蝸牛酶、纖維素酶、果膠酶、B-葡聚糖酶( 北京諾唯信公司) ，鹽酸氟西汀膠囊( 上海中西制藥有限公司) ，D101 型大孔樹脂( 山東魯抗樹脂廠) ，甲醇為色譜純，水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。NIH 小鼠，18 ～ 22 g，SPF 級，雄性，購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號 SCXK( 粵) 2008-0002。

2 方法與結(jié)果

2. 1 酶解條件的優(yōu)化 以人參皂苷類成分的轉(zhuǎn)化率接近 50% 為目標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)選酶解的pH、溫度和時(shí)間等參數(shù)，人參總皂苷含量以三七葉總皂苷中人參皂苷 Ｒb1，Ｒb2，Ｒc，Ｒb3含量總和標(biāo)示。轉(zhuǎn)化率 = ( 1 － 酶解后人參總皂苷含量/酶解前人參總皂苷含量) ×100%

2. 1. 1 酶的種類 精密稱取三七葉總皂苷 4 份，每份 4 g，分別溶解于 100 mL 磷酸鹽緩沖液( pH 4. 5)中，80 ℃水浴加熱 30 min( 消除其他酶的影響) ，冷卻至室溫，依次加入蝸牛酶、纖維素酶、果膠酶、B-葡聚糖酶0. 5 g 溶解，50 ℃水浴12h，自來水冷卻至室溫停止反應(yīng)，濃縮，干燥，即得酶解物樣品，測定三七葉總皂苷酶解前后人參總皂苷含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用蝸牛酶酶解時(shí)，人參總皂苷含量明顯減少，而采用其自發(fā)活動(dòng)曠場實(shí)驗(yàn)抗抑郁活性評價(jià)他酶酶解時(shí)人參總皂苷含量變化不大。

2. 1. 2 酶解 pH 精密稱取三七葉總皂苷 7 份，每份 4 g，分別溶解于 100 mL 不同 pH( 3. 0，3. 5，4. 5，5. 5，6. 5，7. 5，8. 0) 的磷酸鹽緩沖液中，80 ℃ 水浴加熱30 min，冷卻至室溫，各加入蝸牛酶 0. 5 g，其他操作同 2. 1. 1 項(xiàng)，計(jì)算人參總皂苷轉(zhuǎn)化率分別為15. 34% ，24. 74% ，47. 38% ，39. 23% ，20. 54% ，11. 03% ，3. 66% ，表明隨著 pH 的增大，轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在偏酸性條件下酶解效果較好，確定酶解 pH 4. 5。

2. 1. 3 酶解溫度 精密稱取三七葉總皂苷 5 份，每份 4 g，分別溶解于 100 mL pH 4. 5 的磷酸鹽緩沖液中，80 ℃水浴加熱 30 min，冷卻至室溫，各加入蝸牛酶 0. 5 g，在不同水浴溫度下( 40，50，60，70，80 ℃)反應(yīng) 12 h，其他操作同 2. 1. 1 項(xiàng)，計(jì)算人參總皂苷轉(zhuǎn)化率分別為 23. 96%，54. 88%，63. 42%，44. 68%，11. 06% ，說明溫度過高可能會(huì)導(dǎo)致酶失活，綜合考慮，確定酶解溫度 50 ℃。

2. 1. 4 酶解時(shí)間 精密稱取三七葉總皂苷 5 份，每份 4 g，分別溶解于 100 mL pH 4. 5 的磷酸鹽緩沖液中，80 ℃水浴加熱 30 min，冷卻至室溫，各加入蝸牛酶0. 5 g，依次于50 ℃水浴中反應(yīng) 6，9，12，15，18 h，其他操作同 2. 1. 1 項(xiàng)，計(jì)算人參總皂苷轉(zhuǎn)化率分別為30. 78%，42. 61%，53. 75%，64. 11%，83. 72%，故確定酶解時(shí)間 12 h。

2. 2 酶解產(chǎn)物的富集純化

采用樹脂法富集純化酶解產(chǎn)物中的人參皂苷類成分，酶解產(chǎn)物用水溶解，以 2 BV·h

－ 1的流速通過預(yù)處理好的 D-101 型大孔樹脂柱內(nèi)進(jìn)行吸附，加 3 BV 水以 4 BV·h－ 1的流速洗脫雜質(zhì)，用 90% 乙醇 4 BV 洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，干燥，即得。

2. 3 酶解產(chǎn)物的含量測定 人參皂苷 Ｒb1，Ｒb2，Ｒc，Ｒb3的含量測定方法參照文獻(xiàn)。酶解產(chǎn)生的原人參二醇、人參皂苷 Ｒh2和人參皂苷 C-K 的HPLC 測 定 條 件 為 Ultimate AQ-C18色 譜 柱( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，流動(dòng)相甲醇-水( 86 ∶

14) ，流速 0. 7 mL·min－ 1，柱溫 25 ℃，檢測波長 203nm，進(jìn)樣量 10 μL。結(jié)果顯示三七葉總皂苷中人參皂苷 Ｒb1，Ｒc，Ｒb2，Ｒb3，Ｒh2，C-K 及原人參二醇的質(zhì) 量 分 數(shù) 分 別 為 3. 78% ，9. 35% ，3. 46% ，18. 58% ，1. 26% ，0. 66% ，0. 89% ，而 酶解產(chǎn)物中上述成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)則分別為 2. 62% ，5. 89% ，

1. 37% ，8. 12% ，8. 73% ，4. 32% ，5. 67% 。酶解產(chǎn)物經(jīng)過樹脂純化后轉(zhuǎn)移率達(dá) 86. 37% 。三七葉總皂苷酶解后人參皂苷 Ｒb1，Ｒb2，Ｒc，Ｒb3的質(zhì)量分別減少了 40. 14% ，45. 59% ，65. 80% ，62. 25% ，而微量的人參皂苷 Ｒh2，C-K 和原人參二醇則明顯增加，表明三七葉總皂苷經(jīng)蝸牛酶水解后，人參皂苷類成分發(fā)生了一定程度的降解，生成相應(yīng)的次級皂苷或皂苷元。

2. 4 抗抑郁活性評價(jià)

2. 4. 1 建模方法

每天隨機(jī)給予小鼠任意一種刺激( 行為限制 30 min，4 ℃ 冰水游泳 2 min，斷水24 h，斷糧 24 h，夾尾 5 min，通宵照明，白噪音30 min及 45 ° 斜籠等) ，使小鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生，在建模前及建模后每隔 1 周進(jìn)行行為學(xué)指標(biāo)測定，以判斷慢性溫和性不可預(yù)知應(yīng)激模型( CMS) 是否建模成功。

2. 4. 2 動(dòng)物分組及給藥 小鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，人參皂苷 Ｒb3組，氟西汀組，酶解產(chǎn)物低、中、高劑量組共 7 組。建模成功后，人參皂苷 Ｒb3組按40 mg·kg－ 1給予人參皂苷 Ｒb3溶液，氟西汀組按10 mg·kg－ 1給予氟西汀溶液，酶解產(chǎn)物低、中、高劑量組分別按 20，40，80 mg·kg－ 1給藥，空白組和模型組小鼠給予等劑量蒸餾水，連續(xù)給藥 3 周。

2. 4. 3 慢性應(yīng)激建模及**對小鼠體重的影響分別在造模前 1 d( 0 周) 、造模期( 第 1 ～6 周) 及給藥期( 第 7 ～ 9 周) 測定小鼠體重，觀測小鼠體重變化情況，結(jié)果見表 1。建模前 1 周為小鼠適應(yīng)期，各組間小鼠無顯著性差異; 第 1 ～2 周時(shí)各組小鼠體重均有所增加，但各組間無顯著性差異; 第 3 ～ 6 周空白組小鼠體重持續(xù)增加，模型組及各給藥組小鼠體重則持續(xù)減少，與空白組相比具有顯著性差異( 0 ～

4 周試驗(yàn)數(shù)據(jù)省略) 。第 6 周時(shí)，與空白組相比，模型組、人參皂苷 Ｒb3組、氟西汀組及酶解產(chǎn)物不同( 低、中、高) 劑量組小鼠體重分別降低了 16. 44%，16. 00% ，16. 00% ，16. 89% ，16. 00% ，17. 33% ，慢性應(yīng)激導(dǎo)致小鼠體重的明顯減少表明建模成功。第7 ～ 9 周為給藥期，除模型組外，其余 6 組小鼠體重呈明顯增加趨勢。在第9 周時(shí)，人參皂苷 Ｒb3組、氟西汀組及酶解產(chǎn)物不同( 低、中、高) 劑量組與模型組相比，小鼠體重分別增加了 9. 84%，15. 03%，9. 33% ，12. 44% ，18. 13% ，均具有極顯著性差異; 但與空白組相比，小鼠體重分別降低了 12. 03%，7. 88% ，12. 45% ，9. 96% ，5. 39% ，均具有顯著性差異，表明各給藥組小鼠給藥 3 周后，小鼠體重雖能顯著提高，但不能恢復(fù)至正常水平。在第 7 ～9 周的給藥期內(nèi)，給予人參皂苷 Ｒb3和氟西汀后可極顯著地恢復(fù)小鼠體重，表現(xiàn)出明顯的抗抑郁作用; 而三七葉總皂苷酶解產(chǎn)物則呈現(xiàn)較低劑量發(fā)生抗抑郁作用的時(shí)間較長，高劑量起效較快的特點(diǎn)。

2. 4. 4 慢性應(yīng)激建模及**對小鼠糖水消耗的影響 CMS 小鼠會(huì)出現(xiàn)快感缺失現(xiàn)象，通常以糖水偏好率行為學(xué)指標(biāo)來測定小鼠快感缺失的程度，同時(shí)可反映各給藥組的抗抑郁藥效。建模前對小鼠糖水消耗基線進(jìn)行測定，結(jié)果空白組、模型組、人參皂苷Ｒb3組、氟西汀給藥組及酶解產(chǎn)物不同( 低、中、高)劑量 組 的 糖 水 消 耗 量 分 別 為 ( 6. 82 ± 0. 497) ，( 6. 92 ±0. 462) ，( 6. 78 ± 0. 447) ，( 6. 87 ± 0. 359) ，( 6. 69 ±0. 765) ，( 6. 89 ± 0. 554) ，( 6. 85 ± 0. 571)

g，各組間無顯著性差異，表明可以進(jìn)行糖水消耗試驗(yàn)。采用雙瓶法，試驗(yàn)前斷水24 h，分別給予2 個(gè)已稱重的喂水瓶，一瓶為 1% 蔗糖水，一瓶為自來水，24 h 后分別稱定 2 個(gè)水瓶的質(zhì)量，按糖水偏好率 =蔗糖瓶飲用量/( 蔗糖瓶飲用量 + 自來水瓶飲用

量) ×100%計(jì)算，見表 2。結(jié)果顯示建模第 1 ～4 周各建模組小鼠的糖水偏好率均有一定下降，但與空白組相比無顯著性差異，故試驗(yàn)數(shù)據(jù)省略; 在第 5 周時(shí)，各建模組小鼠的糖水偏好率下降至約 68. 5%，與空白組相比下降明顯，但仍無顯著性差異; 建模第6 周時(shí)各建模組小鼠的糖水偏好進(jìn)一步下降，與空白組相比，模型組、人參皂苷Ｒb3組、氟西汀組及酶解產(chǎn) 物 不 同 ( 低、中、高) 劑 量 組 分 別 降 低 了12. 98% ，11. 44% ，13. 24% ，16. 07% ，16. 32% ，11. 57% ，均具有顯著性差異，表明建模成功。第7 ～ 9周為給藥期，與模型組相比，第 7 周時(shí)氟西汀給藥組小鼠糖水偏好率明顯提高了 23. 30%，而酶解物產(chǎn)物不同劑量組和人參皂苷 Ｒb3組小鼠則無明顯影響; 第8 周時(shí)人參皂苷 Ｒb3組、氟西汀組及酶解產(chǎn)物不同( 低、中、高) 劑量組小鼠的糖水偏好率較模型 組 分 別 提 高 了 25. 09%，26. 19%，21. 95%，

23. 19% ，21. 06% ，均具有極顯著性差異，第 9 周時(shí)上述各給藥組的糖水偏好率分別提高了 15. 47%，20. 85% ，22. 64% ，19. 87% ，19. 38% ，同樣具有極顯著性差異，逆轉(zhuǎn)了 CMS 小鼠的快感缺失現(xiàn)象，表現(xiàn)出良好的抗抑郁作用。在第 7 周時(shí)，給予氟西汀后可馬上恢復(fù) CMS 小鼠的快感缺失行為，起效較快，而三七葉總皂苷酶解產(chǎn)物及人參皂苷 Ｒb3在第 8，9周時(shí)才發(fā)揮作用，呈現(xiàn)起效較慢的特點(diǎn)。

2. 4. 5 慢性應(yīng)激建模及**對小鼠自主活動(dòng)的影響 將小鼠放入 ZH-ZFT 型自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)裝置中，適應(yīng) 2 min，錄像記錄小鼠在隨后 5 min 內(nèi)的活動(dòng)總路程，使用附帶的分析系統(tǒng)對錄得結(jié)果進(jìn)行分析。在建模前及建模 1 ～ 4 周時(shí)，各給藥組、模型組和空白組間均無顯著性差異，但各給藥組、模型組和空白組的自主活動(dòng)總路程均呈現(xiàn)較明顯的下降趨勢，試驗(yàn)數(shù)據(jù)省略，建模第 5 ～9 周時(shí)小鼠自主活動(dòng)記錄見表 3。第 5 ～6 周時(shí)，各給藥組、模型組和空白組小鼠的自主活動(dòng)總路程繼續(xù)呈現(xiàn)較明顯的下降趨勢，但各給藥組、模型組和空白組間依然無顯著性差異，表明長期飼養(yǎng)及慢性應(yīng)激可降低小鼠的自主活動(dòng)水平。第 7 ～9 周為給藥期，第 7 周時(shí)各組小鼠的自主活動(dòng)水平進(jìn)一步下降，但無顯著性差異; 第 8 ～ 9 周給藥后，各給藥組小鼠的自主活動(dòng)水平呈現(xiàn)明顯的恢復(fù)趨勢，與模型組相比，第 9 周時(shí)氟西汀組及酶解產(chǎn)物不同( 低、中、高) 劑量組小鼠的自主活動(dòng)水平分別提高了 12. 06%，8. 35%，41. 30%，13. 33%，表明各給藥組的自主活動(dòng)水平有一定程度的改善。自發(fā)活動(dòng)曠場實(shí)驗(yàn)抗抑郁活性評價(jià)

3 討論

三七葉總皂苷含有人參皂苷 Ｒb1，Ｒb2，Ｒc，Ｒb3等成分，預(yù)試驗(yàn)對不同酶解程度的三七葉總皂苷產(chǎn)物進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參皂苷類成分的轉(zhuǎn)化率接近 50%時(shí)，酶解產(chǎn)物的抗抑郁活性*佳。CMS 是抑郁癥研究中常用的動(dòng)物抑郁模型，可模擬人類抑郁癥中體重下降、快感缺失、自主活動(dòng)下降等核心癥狀。NIH 小鼠建模 6 周后，呈現(xiàn)出體重下降、快感缺失、行動(dòng)遲緩等抑郁癥相似的行為表現(xiàn)，說明建模成功; 在第 7 ～9 周給藥期內(nèi)，三七葉總皂苷酶解產(chǎn)物能恢復(fù)小鼠的體重，提升小鼠的糖水偏好率，緩解小鼠快感缺失情況，恢復(fù)小鼠自主活動(dòng)水平，表明酶解產(chǎn)物具有良好的抗抑郁作用。抑郁癥作為慢性**，需要長期服藥，故必須要考慮抗抑郁藥的長期耐受性和與其他**相互作用的**性等問題。目前，主流的抗抑郁西藥如氟西汀、帕羅西汀、西酞普蘭等雖然起效快，但由于化學(xué)結(jié)構(gòu)特征和作用機(jī)制的特點(diǎn)，不可避免地會(huì)產(chǎn)生 5-HT 綜合征、胃腸道反應(yīng)、性功能障礙、抗****異常分泌綜合征、戒斷反應(yīng)等**反應(yīng)。三七葉總皂苷作為**補(bǔ)腦藥用于精神科**已有多年，**可靠，毒副作用少，至今未發(fā)現(xiàn)**反應(yīng)的報(bào)道，因此，以三七葉總皂苷為原料開發(fā)療效顯著、低毒、**的人參皂苷類抗抑郁新藥具有重要意義。