摘要：目的：觀察復(fù)合天然**提取物對 2 型糖尿病腦病大鼠認(rèn)知功能的影響。方法：SPF 級健康成年雄性 SD 大鼠分為 5 組，空白對照組、糖尿病腦病組、復(fù)合天然**提取物低、中、高劑量組，每組 7 只。以高脂飼料喂養(yǎng) 4 周，后予30mg/kg 的劑量一次性腹腔注射 1%的鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)溶液建立糖尿病模型?？崭寡逡葝u素水平(fasting serum insulin,FSI)、口服葡萄糖耐量實驗(oral glucose tolerance test,OGTT)、胰島素耐量實驗(insulin tolerance test,ITT)驗證模型成立。第 8 周開始復(fù)合天然**提取物**，對糖尿病腦病干預(yù)組給予低、中、高劑量復(fù)合天然**提取物，** 5 周。在第 12 周進行跳臺實驗(Step downtest)和Morris 水迷宮實驗(Morris watermaze test)進行行為學(xué)測試，比較各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的改變。 結(jié)果：糖尿病腦病大鼠跳臺實驗反應(yīng)期延長，錯誤次數(shù)增加，復(fù)合天然**提取物高劑量組干預(yù)可改善糖尿病腦病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，使跳臺實驗反應(yīng)期縮短，錯誤次數(shù)減少 ；通過水迷宮實驗檢測發(fā)現(xiàn)，糖尿病腦病大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶功能下降；高劑量復(fù)合天然**提取物可以對其進行糾正。 結(jié)論：復(fù)合天然**提取物有改善糖尿病腦病大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能的作用。

關(guān)鍵詞：糖尿病腦病 復(fù)合天然**提取物 認(rèn)知功能

目前隨著人口老齡化和生活方式的改變，2型糖尿病的發(fā)病率逐年增長，已成為威脅全人類健康的主要問題。我國糖尿病患病率居世界**位，2010年楊文軍教授發(fā)表于《新英格蘭雜志》的研究結(jié)果表明：中國20歲以上的**糖尿病患病率已達9．7％，而糖尿病前期(空腹血糖受損和糖耐量減低)的患病率已經(jīng)達15．5％。這些結(jié)果令人震驚，同時 也使我們進一步認(rèn)識到糖尿病的患病率已大幅提高，并成為威脅我國人民身體健康的主要慢性病之一，而糖尿糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的研究是關(guān)系國計民生的重要問題。

過去10年大量的流行病學(xué)研究表明DM與認(rèn)知障礙有關(guān)聯(lián)，特別是2TDM與老年癡呆（Alzheimer disease,AD）關(guān)系尤為密切，T2DM即使不發(fā)生腦卒中或嚴(yán)重的低血糖，僅持續(xù)的高血糖、高血脂、高膽固醇血癥及高血壓導(dǎo)致的代謝綜合癥，也可以導(dǎo)致**神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷而影響大腦認(rèn)知功能，表現(xiàn)為輕、中度認(rèn)知功能障礙，學(xué)習(xí)和記憶能力下降，甚至發(fā)生癡呆。動物實驗研究也證實糖尿病鼠存在學(xué)習(xí)、記憶功能障礙，并且糖尿病鼠腦部神經(jīng)元出現(xiàn)了AD的特異性病理學(xué)改變：Aβ沉積及tau的異常磷酸化，及由其導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞退化。

目前尚無有針對性的特效**，只是從改善學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能入手對癥緩解，常用的改善學(xué)習(xí)認(rèn)知的**包括膽堿能藥、谷氨酸受體調(diào)控劑、抗氧化劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子及受體生成的**、**類等幾類，由于毒副作用和**反應(yīng)影響，患者往往無法堅持長期應(yīng)用，從而限制了這些**的廣泛臨床應(yīng)用。本研究的組分中藥復(fù)合天然**提取物是將具有**，**益智作用的天然**提取物組方，現(xiàn)通過行為學(xué)檢測對其改善糖尿病腦病大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知功能作用進行觀察。

材料和方法

（一） 實驗材料

1. 實驗動物及分組:SPF 級健康成年雄性 SD（Sprague-Dawley）大鼠，體重200±20g，8 周齡。SPF 級環(huán)境飼養(yǎng) 3 天后，隨機分為空白對照組（Cont）、糖尿病組（DM）。在 2 型糖尿病模型成功后，再將糖尿病組大鼠隨機分為糖尿病腦病組（DE）、復(fù)合天然**提取物低劑量**組（LDE）、復(fù)合天然**提取物中劑量**組（MDE）和復(fù)合天然**提取物高劑量**組（HDE）4 組，每組 7 只。

2.模型建立:采用高脂飲食加注射小劑量鏈脲佐菌素（strepozotocin，STZ）的造模方法建立2型糖尿病模型。高脂飼料喂養(yǎng)4周后，模型組按30mg/kg的劑量一次性腹腔注射1%STZ溶液，10min內(nèi)注射完?？瞻讓φ战M腹腔內(nèi)注射等體積量檸檬酸緩沖液。72h后尾靜脈采血測量隨機血糖，隨機血糖＞16.7mmol/L的大鼠確定為糖尿病模型造模成功。此后每10d測一次隨機血糖，隨時剔除血糖低于16.7mmol/L的大鼠?？崭寡逡葝u素水平(fasting serum insulin,FSI)、口服葡萄糖耐量實驗(oral glucose tolerance test,OGTT)、胰島素耐量實驗(insulin tolerancetest,ITT)驗證模型成立。

3. ****

造模成功后第 8 周開始至行為學(xué)檢測完畢，停止施加造模因素，復(fù)合天然**提取物按 39mg/kg、104mg/kg 、390mg/kg 三個劑量，每日 2 次灌胃，期間間隔 12 小時，每次按 1mL/100g 體重計算；正常對照組及糖尿病腦病組予相應(yīng)等體積量的生理鹽水灌胃，共 35 天。

4. 行為學(xué)測試

4.1 跳臺測試(step down test)：將大鼠放入跳臺箱中自由活動 5min 熟悉環(huán)境，然后將箱底的金屬桿通以 36v 交流電，其正常反應(yīng)是跳上橡膠制的平臺以躲避傷害性刺激。記錄大鼠**跳到平臺的時間(反應(yīng)期)和 5min 內(nèi)大鼠跳到金屬桿上的次數(shù)(錯誤次數(shù))，作為學(xué)習(xí)成績。24h 后重復(fù)實驗，將大鼠放到平臺上并同時通電，記錄其**次跳下平臺的時間(潛伏期)和 5min 內(nèi)的錯誤次數(shù)，從而反映大鼠的記憶保持能力。

4.2 Morris 水迷宮測試（Morris watermaze test）：各組大鼠在**干預(yù)30d 后開始水迷宮測試。(1)定位航行實驗：歷時 5 天，第 1 天為適應(yīng)性訓(xùn)練，將池中平臺撤去，使大鼠在池中自由游泳 120s，以后 4 天每天訓(xùn)練 4 次，每次訓(xùn)練間隔 60s。訓(xùn)練時隨機選擇一個入水點入水（四次分別從四個象限入水），將大鼠面向池壁放入水中，迫使大鼠學(xué)習(xí)尋找設(shè)于水面以下的平臺。記錄 120s內(nèi)尋找平臺所需時間（潛伏期）。如果大鼠入水 120s 內(nèi)未能找到平臺，則將其引導(dǎo)至平臺，并在平臺停留60s，潛伏期記錄為 120s。(2)空間探索實驗：定位航行實驗結(jié)束后撤除平臺，任選一個入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄 120s內(nèi)跨越原平臺位置的次數(shù)。

5.統(tǒng)計學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示。實驗結(jié)果采用 SPSS16.0 軟件進行處理。多組間均數(shù)比較采用重復(fù)測量資料的方差分析；兩組間均數(shù)比較采用 t 檢驗。顯著性標(biāo)準(zhǔn)界值均定為 P<0.05。

結(jié)果

一、2 型糖尿病模型建立

模型建立后 DM 組大鼠出現(xiàn)了多飲、多食、多尿等糖尿病癥狀，后期逐漸出現(xiàn)形體消瘦，體重下降。STZ 注射 72h 后 DM 組大鼠隨機血糖明顯高于空白對照組大鼠（P<0.01）；在口服葡萄糖耐量實驗（OGTT）中，DM 組大鼠各點血糖值均大于空白對照組大鼠（P<0.01），且在 120min 時血糖仍高于 0min 時血糖，說明糖尿病模型大鼠調(diào)節(jié)葡萄糖機能受損，存在糖耐量異常；在胰島素耐量實驗（ITT）中，糖尿病模型大鼠血糖下降速率比空白對照組大鼠血糖下降速率慢，說明糖尿病模型大鼠存在胰島素抵抗?？崭寡逡葝u素水平（FSI）糖尿病模型組明顯高于空白對照組（P<0.05），說明糖尿病模型組存在明顯的胰島素抵抗。

二、行為學(xué)檢測

通過跳臺實驗反應(yīng)動物的學(xué)習(xí)記憶獲得以及鞏固能力，

跳臺實驗**天主要反映的是大鼠的學(xué)習(xí)和記憶獲取能力，從表中可以看出Cont 組和 HDE 組跳臺反應(yīng)期明顯短于其他各組（P <0.05），錯誤次數(shù)也較其他各組少（P <0.05），而 Cont 組和 HDE 組進行比較無顯著性差異（P >0.05）。

跳臺實驗的**天主要反映大鼠對頭**學(xué)習(xí)內(nèi)容的記憶鞏固能力，結(jié)果表明 Cont 組和 HDE 組的潛伏期較其他各組短（P<0.05），而錯誤次數(shù)少（P <0.05），而二者之間比較無顯著性差異（P >0.05）；其中 HDE 組的所有大鼠在測試潛伏期內(nèi)均未走下平臺。

3.2 通過 Morris 水迷宮檢測動物的空間記憶能力，

各組大鼠水迷宮滯留時間的變化趨勢 ,頭3天均呈下降趨勢，第4天趨于平穩(wěn)。其中， DE、LDE、MDE組的變化趨勢及潛伏期接近，折線幾乎重和；HDE和Cont組比較接近，滯留時間明顯較其他3組縮短。進一步進行統(tǒng)計學(xué)分析DE、LDE、MDE組找到平臺的時間，即在水中的滯留時間均明顯長于Cont組( P < 0. 05)；而HDE與Cont組尋找平臺的時間差異不明顯；與DE、LDE、MDE組找到平臺的時間比較差異則顯著( P < 0. 05)。

討論：

胰島素抵抗與胰島功能受損是 2 型糖尿病的發(fā)病機理中不可缺少的兩個重要因素，本研究應(yīng)用高脂飲食喂養(yǎng) 1 個月，導(dǎo)致外周胰島素抵抗。在此基礎(chǔ)上結(jié)合小劑量 STZ，使β細(xì)胞部分受損，胰島素分泌相對減少，既使胰島素水平繼續(xù)升高，仍不能有效代償外周胰島素抵抗，因而導(dǎo)致糖尿病發(fā)病。此發(fā)病過程與 2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程相似，STZ 的劑量小到既能保證糖尿病的發(fā)生，又能避免胰島素合成和分泌能力的耗竭，不至于成為典型的 1 型糖尿病模型。故而本研究采用該方法建立 2 型糖尿病動物模型。

臨床研究表明T2DM病人中，反應(yīng)認(rèn)知功能的簡短精神狀態(tài)量表成績較非糖尿病對照組比較積分明顯下降，而且老年糖尿病患者的認(rèn)知級水平下降更為明顯. Convit 進一步研究表明T2DM的認(rèn)知下降與海馬功能密切相關(guān)，并且與血糖控制程度、年齡、受教育程度、高膽固醇水平、代謝失常等因素正相關(guān). 并且，在T2DM病人也出現(xiàn)了特異性的 AD樣病理改變，如 Aβ異常沉積和tau過度磷酸化 ，并*終導(dǎo)致神經(jīng)元退行性病變。動物實驗中，Reisi 研究報告糖尿病模型建立8周后患者逐漸出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，并在12周時達到極限。Biessels等研究亦發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)的DM大鼠成模11周時，大鼠在水迷宮測試時已經(jīng)出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降。張松筠、盛樹力等分別采用DM大鼠，在模型建立12周時觀察大鼠的認(rèn)知功能變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其水迷宮成績下降，海馬神經(jīng)元的存活及凋亡通路蛋白表達異常，海馬突觸數(shù)量減少，突觸間隙增寬，且病變程度與病程正相關(guān)。因此，本實驗選取糖尿病大鼠成模12周觀察其認(rèn)知功能的改變。我們的實驗結(jié)果表明：跳臺實驗中，**天反映學(xué)習(xí)和記憶的獲得能力的潛伏期及錯誤次數(shù)，在糖尿病腦病各組明顯低于正常對照組，差異顯著（p＜0.05）；而**天反映記憶鞏固能力的潛伏期與錯誤次數(shù)，亦得到一致的結(jié)論，并且經(jīng)過復(fù)合天然**提取物的干預(yù)，特別是高劑量組復(fù)合天然**提取物的干預(yù)后大鼠的記憶活動能力以及記憶鞏固能力普遍提高，其成績與正常對照組比較沒有統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）。探索空間目標(biāo)能力的水迷宮實驗中得到一致的結(jié)果，表明在長期高血糖和胰島素抵抗的情況下，2型糖尿病大鼠的海馬存在學(xué)習(xí)和記憶能力明顯下降。

我國是舉世公認(rèn)的天然**大國，用***治病、養(yǎng)生歷史悠久，在天然**抗衰老及改善學(xué)習(xí)、記憶、防治癡呆及糖尿病方面積累了許多寶貴經(jīng)驗。2009年Brian H[24]運用系統(tǒng)綜述的方法研究和評估了中藥**癡呆的有效性和**性，他們針對中文和英文的數(shù)據(jù)庫中截止至2007年2月的所有文獻研究進行分析，結(jié)果表明***可以有效的改善認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶障礙,**和延緩早期癡呆 (包括血管性癡呆和阿爾茲海默病)的發(fā)生、發(fā)展，而且沒有驗證的不放反應(yīng)和副作用被報告。因此，該研究指出來自天然的***成分可以有效分改善認(rèn)知功能，應(yīng)用有廣泛的應(yīng)用前景和重要的臨床意義。

復(fù)合天然**提取物是由來自綠茶的茶氨酸、茶多酚提取物和來自中藥人參的人參皂苷，以及來自遠(yuǎn)志的遠(yuǎn)志皂苷配比組成，具有****益智之功效。我們用其對2型糖尿病大鼠進行干預(yù)，接受35天復(fù)合天然**提取物**后，復(fù)合天然**提取物能夠較好的改善糖尿病相關(guān)認(rèn)知功能減退，提高其跳臺、水迷宮成績，起到改善認(rèn)知功能的作用。高劑量的復(fù)合天然**提取物對糖尿病腦病大鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知功能有較好的改善作用，接近于空白大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，這提示我們采用的天然**組方的組分中藥可以改善長期高血糖及胰島素抵抗導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙。

我們的研究結(jié)果證實了以茶氨酸和茶多酚為主要成分，組方而成的天然**復(fù)合物能夠較好的改善2型糖尿病大鼠的認(rèn)知功能，提高其獲得信息，回憶及鞏固信息的學(xué)習(xí)能力，同時能夠提高其空間記憶和空間探索等認(rèn)知功能。正因為該**有較好的**效果，而其詳細(xì)的作用機制及作用靶點將值得進一步深入的研究及探討。 本文為摘錄整理篇。