摘要: 目的 測評(píng)環(huán)境相關(guān)恐懼模型大鼠的行為學(xué)變化及疏肝清熱健脾法的干預(yù)效果。方法 以環(huán)境相關(guān)恐懼刺激法建立廣泛性焦慮大鼠模型，造模同時(shí)進(jìn)行**干預(yù)，應(yīng)激結(jié)束后以高架十字迷宮試驗(yàn)進(jìn)行測評(píng)，評(píng)價(jià)該模型的行為學(xué)變化及疏肝清熱健脾法的干預(yù)效果。結(jié)果 造模結(jié)束后的大鼠易激惹，運(yùn)動(dòng)活力降低，高架十字迷宮測試開放臂活動(dòng)次數(shù)及時(shí)間減少，封閉臂活動(dòng)傾向增多。**組比模型組整體運(yùn)動(dòng)活力提高，開放臂活動(dòng)次數(shù)及時(shí)間增多，封閉臂活動(dòng)傾向減少。結(jié)論 環(huán)境相關(guān)恐懼模型大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)出明顯的焦慮，能夠較好模擬廣泛性焦慮的發(fā)病狀態(tài)，疏肝清熱健脾法可降低該模型大鼠的焦慮水平。

關(guān)鍵詞: 環(huán)境相關(guān)恐懼模型; 廣泛性焦慮障礙; 行為學(xué); 疏肝清熱健脾; 大鼠

焦慮癥是一類以恐懼、擔(dān)憂、緊張不安等焦慮情緒為核心癥狀的神經(jīng)癥，主要包括急性發(fā)作的驚恐障礙( Panic disorder，簡稱 PD) 和慢性病程的廣泛性焦慮障礙( generalized anxiety disorder，簡稱 GAD)。

隨著現(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏的加快，GAD 的發(fā)病日趨普遍。其慢性病程、易復(fù)發(fā)、影響生活質(zhì)量等特點(diǎn)，對(duì)人類身心健康的危害較大，因而對(duì) GAD 的發(fā)病機(jī)制、防治措施開展深入研究**必要性和緊迫性。本研究用環(huán)境相關(guān)恐懼應(yīng)激方法建立廣泛性焦慮大鼠模型，并通過對(duì)大鼠行為學(xué)變化的觀察、測評(píng)，對(duì)中藥疏肝清熱健脾法的干預(yù)作用進(jìn)行探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料

健康 Wistar 雄性大鼠 48 只，SPF 級(jí)，10 周齡，體質(zhì)量( 200 ±10) g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào): SCXK( 京) 2010-0001。動(dòng)物購進(jìn)后飼養(yǎng)于 SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由攝食飲水，光照節(jié)律12L/12D( 6: 00 ～18: 00) ，室溫( 20 ±2) ℃，相對(duì)濕度 50% ～60%，保持安靜。高架十字迷宮( 開放臂 50 cm ×10 cm，閉合臂 50 cm × 10 cm × 40 cm，中央?yún)^(qū) 10 cm ×10 cm) 由上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品型號(hào)為: XＲ-XG201。Xmaze 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)，由上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)，與高架十字迷宮設(shè)備配套。聲電刺激儀，由上海軟隆科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)。丹梔逍遙散( 柴胡 15g，梔子10 g，牡丹皮 10 g，炒白術(shù) 15 g 等) 購于北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，造模前按大鼠用量 10. 5 g/ ( kg·d) ，灌胃劑量每次 2 mL 煎煮，煎取后濃縮至生藥濃度 1. 05 g/mL，貯存于 4 ℃冰箱冷藏備用，灌胃前以溫水隔水加熱。鹽酸丁螺環(huán)酮( 商品名: 一舒，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào): 國藥準(zhǔn)字H19991024) ，按**用量 20 mg / ( 70 kg·d) 的 7 倍、灌胃劑量每次2 mL計(jì)算大鼠用量 2．0 mg/( kg·d) ，以濃度0．20 mg/mL 溶于蒸餾水中，灌胃前混勻。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2. 1 動(dòng)物分組與給藥 動(dòng)物預(yù)養(yǎng) 1 周后，首先將 48只動(dòng)物進(jìn)行曠場試驗(yàn)，以水平運(yùn)動(dòng)總格數(shù)與直立次數(shù)( 垂直運(yùn)動(dòng)) 之和為參考，按正態(tài)分布去掉置信區(qū)間95% 以外的大鼠 8 只，剩余 40 只大鼠按水平運(yùn)動(dòng)與垂直運(yùn)動(dòng)之和隨機(jī)分為正常組、模型組、對(duì)照組、**組，每組 10 只。自造模第 1 天起，正常組不予任何處理，自由攝食、飲水，模型組予以蒸餾水灌胃，對(duì)照組予以丁螺環(huán)酮水溶液灌胃，**組予以中藥丹梔逍遙散濃縮藥汁灌胃，連續(xù) 21 d。

2. 2 模型制備 動(dòng)物預(yù)養(yǎng)及分組結(jié)束后，模型組、對(duì)照組、**組與灌胃同步進(jìn)行環(huán)境相關(guān)恐懼模型的制備。本模型制備分 3 個(gè)階段進(jìn)行應(yīng)激，第 1 階段為條件性訓(xùn)練( 1 d) ，給予大鼠條件性刺激，程序?yàn)椤盁o刺激 180 s→聲音信號(hào) 30 s→足底電擊 2 s→無刺激20 s”，訓(xùn)練 10 次; 第 2 階段為環(huán)境相關(guān)( 2 d) ，將大鼠放入**階段環(huán)境中，評(píng)價(jià)環(huán)境相關(guān)的條件性恐懼程度，程序?yàn)椤盁o刺激180 s”; 第3 階段為改變的環(huán)境信息( 2 d) ，改變環(huán)境信息后觀察大鼠的條件性恐懼程度，程序?yàn)椤盁o刺激 180 s→聲音信號(hào) 180 s→無刺激6 s”。以上流程循環(huán) 4 次，共 20 d。聲電刺激儀設(shè)定電流為 1. 2 mA，聲音信號(hào)采用“滴滴”樣相同頻率聲音。模型制備同時(shí)，觀察并記錄大鼠僵滯時(shí)間，僵滯時(shí)間記錄由 3 名觀察者觀察結(jié)果平均而得。模型制備期間，3 組大鼠的應(yīng)激操作于每天 8: 00 ～ 11: 30進(jìn)行，應(yīng)激前大鼠提前 30 min 進(jìn)入應(yīng)激實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境，操作時(shí)抓取動(dòng)物輕柔。

2. 3 高架十字迷宮測試 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室保持安靜通風(fēng)，恒溫 22 ℃，濕度 50% ～60%，室內(nèi)暗光，光線自天花板反射到高架十字迷宮測試區(qū)。迷宮由兩個(gè)開放臂( 50 cm × 10 cm) 、兩個(gè)封閉臂( 50 cm × 10 cm × 40cm) 、一個(gè)連接四臂的中央平臺(tái)( 10 cm × 10 cm) 組成，開放臂與封閉臂互相垂直成十字形。測試前動(dòng)物提前60 min 進(jìn)入房間適應(yīng)環(huán)境，測試時(shí)實(shí)驗(yàn)人員輕柔抓取大鼠并迅速輕放入 EPM 中央平臺(tái)處，放置時(shí)使大鼠頭部正對(duì)其中一個(gè)開放臂，每只大鼠測試時(shí)間 5 min，各組交叉進(jìn)行，測試時(shí)攝像視頻系統(tǒng)記錄大鼠行為表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)人員可通過顯示器觀察大鼠迷宮上的活動(dòng)，每只大鼠測試結(jié)束后將排泄物**干凈，并以酒精擦拭迷宮底部，以免影響下只大鼠行為表現(xiàn)。高架十字迷宮測試于造模結(jié)束次日 15: 00 ～18: 00 進(jìn)行，所有大鼠測試結(jié)束后，統(tǒng)一分析視頻，記錄并整理大鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)、進(jìn)入開放臂時(shí)間、進(jìn)入封閉臂次數(shù)、進(jìn)入封閉臂時(shí)間、探頭次數(shù)、直立次數(shù)、修飾次數(shù)、排便次數(shù)，并計(jì)算進(jìn)入開放臂與封閉臂次數(shù)之和、開放臂次數(shù)占總次數(shù)百分比、開放臂時(shí)間占總時(shí)間百分比。

2. 4 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用 SPSS 18. 0 統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，各組數(shù)據(jù)用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差(珋x ± s) 表示。組內(nèi)比較用重復(fù)測量方差分析，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性，驗(yàn)后多重比較采用 LSD 法，以P ＜0. 05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3. 1 造模期間恐懼消退觀察 模型制備過程中，模型組、對(duì)照組、**組在每個(gè)流程中均表現(xiàn)出電擊刺激撤除后的恐懼消退，模型組、對(duì)照組、**組僵滯時(shí)間占總時(shí)間百分比第 2，7，12，17 天組間比較無差異;對(duì)照組僵滯時(shí)間占總時(shí)間百分比第 4，5，8，9，10，13，14，15，18，19，20 天比模型組減少( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，**組僵滯時(shí)間占總時(shí)間百分比第 8，9，10，13，14，15，18，19，20 天比模型組減少( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ;**組僵滯時(shí)間占總時(shí)間百分比與對(duì)照組比較，第2，3，4，7，12，15，17，18，19，20 天差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第 5，8，9，10，13，14 天**組高于對(duì)照組( P ＜0. 05，P ＜ 0. 01) 。對(duì)照組從第 1 個(gè)流程開始( 第 4 天起) 表現(xiàn)出僵滯時(shí)間較模型組有差異，**組從第 2 個(gè)流程開始( 第 8 天起) 僵滯時(shí)間較模型組有差異。結(jié)果見圖 1。

模型組、對(duì)照組、**組組內(nèi)僵滯時(shí)間占總時(shí)間百分比流程間的比較顯示: 第 2，7，12，17 天( 即每個(gè)流程第 2 天) 、第 3，8，13，18 天( 即每個(gè)流程第 3 天) 、第4，9，14，19 天( 即每個(gè)流程第4 天) 及第 5，10，15，20天( 即每個(gè)流程第5 天) 比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3. 2 造模結(jié)束后一般情況及體質(zhì)量變化觀察 造模結(jié)束后肉眼觀察 4 組大鼠神態(tài)、毛發(fā)、飲食、糞便性狀，結(jié)果見模型組、對(duì)照組、**組大鼠較正常組大鼠神態(tài)懶倦，毛發(fā)無光澤，飲食欠積極，活動(dòng)欠活躍，易激惹，少數(shù)大鼠見溏便。且 3 組大鼠與正常組大鼠對(duì)比之差別以模型組尤甚，對(duì)照組及**組次之。造模第 1，2，3 天 4 組大鼠體質(zhì)量無差異，自第 4 天起至造模結(jié)束，正常組與模型組、對(duì)照組、**組比較有差異( P ＜0. 05，P ＜0. 01) ，其中自第 8 天起差異明顯，正常組高于其余 3 組( P ＜0. 01) 。對(duì)照組與模型組第 9天起 至 造 模 結(jié) 束 有 差 異，對(duì) 照 組 高 于 模 型 組( P ＜0. 05，P ＜0. 01) ，**組與模型組第 7 天起至造模結(jié)束有明顯差異，**組高于模型組( P ＜ 0. 01) 。**組與對(duì)照組比較第 9 天起至造模結(jié)束有差異，**組高于對(duì)照組( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，且第 13 天起至造模結(jié)束有明顯差異( P ＜0. 01) 。結(jié)果見圖 2。

3. 3 高架十字迷宮測試 與正常組比較，模型組、對(duì)照組、**組開閉臂活動(dòng)總次數(shù)、開臂活動(dòng)次數(shù)所占比例、開臂活動(dòng)時(shí)間所占比例均減少 ( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) 。對(duì)照組開閉臂活動(dòng)總次數(shù)、開臂活動(dòng)次數(shù)所占比例、開臂活動(dòng)時(shí)間所占比例比模型組增多( P ＜0. 05，P ＜0. 01) 。**組開閉臂活動(dòng)總次數(shù)、開臂活動(dòng)次數(shù)所占比例、開臂活動(dòng)時(shí)間所占比例比模型組明顯增多( P ＜0.01) 。**組開閉臂活動(dòng)總次數(shù)、開臂活動(dòng)次數(shù)所占比例、開臂活動(dòng)時(shí)間所占比例與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表 1。

與正常組比較，模型組、對(duì)照組、**組探頭、直立次數(shù)均減少( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，修飾、排便次數(shù)比正常組增多( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ; 對(duì)照組探頭、直立次數(shù)比模型組增多( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，修飾、排便次數(shù)比模型組減少( P ＜0. 05) ; **組探頭、直立次數(shù)比模型組明顯增多( P ＜0. 01) ，修飾、排便次數(shù)比模型組減少( P ＜0. 05) ; **組探頭、直立、修飾、排便次數(shù)均與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表2。

4 討論

環(huán)境相關(guān)恐懼模型因刺激信號(hào)非明確及刺激不可預(yù)知被認(rèn)為可以較好地模擬彌散而持續(xù)的焦慮狀態(tài)，適合作為 GAD 的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。該模型制備過程中動(dòng)物的僵滯時(shí)間可反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物條件性恐懼記憶的消退程度。高架十字迷宮試驗(yàn)是經(jīng)典的可以有效測量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物焦慮水平的行為學(xué)測試方法。通過對(duì)環(huán)境相關(guān)恐懼模型的制備發(fā)現(xiàn)，每個(gè)刺激流程大鼠均表現(xiàn)出恐懼記憶的消退，應(yīng)激后的大鼠易激惹、運(yùn)動(dòng)活力降低，高架十字迷宮測試中開臂活動(dòng)次數(shù)及時(shí)間相對(duì)減少，提示該模型大鼠焦慮狀態(tài)明顯。

中醫(yī)學(xué)沒有 GAD 的病名，依據(jù) GAD 的病因及臨床表現(xiàn)，將其歸屬于情志**范疇。依照具體的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)辨證認(rèn)為，該病病位主要在肝、心、脾、腎，病理因素見火、痰、濕、瘀多種，所涉證型有肝郁化火、心腎不交、肝郁脾虛、心脾兩虛等，其中肝郁化火證型尤為常見。根據(jù)五行“木克土”及“見肝之病，知肝傳脾”理論，GAD 屬肝郁者往往伴有或引發(fā)脾虛，臨床所見 GAD 患者往往伴神疲、乏力、倦怠、納減等脾虛表現(xiàn)，疏肝清熱健脾法因而被選作本研究的治法。丹梔逍遙散以逍遙散加牡丹皮和梔子而成方，功可疏肝健脾、清熱解郁。

從模型制備過程中對(duì)僵滯時(shí)間的觀察可見，各組在每個(gè)流程不同應(yīng)激階段的僵滯時(shí)間所占百分比組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示大鼠在本模型制備過程中未表現(xiàn)出對(duì)恐懼記憶的長期記憶效果，考慮與每個(gè)流程條件性訓(xùn)練后的恐懼消退有關(guān)。組間比較顯示，中藥疏肝清熱健脾法與丁螺環(huán)酮均可降低大鼠處于應(yīng)激環(huán)境中的僵滯時(shí)間，提示兩者對(duì)恐懼記憶的消退均有鞏固作用，但疏肝清熱健脾法比丁螺環(huán)酮起效慢。行為學(xué)測評(píng)結(jié)果顯示疏肝清熱健脾法與丁螺環(huán)酮均可提高該模型大鼠的運(yùn)動(dòng)活力，有效降低焦慮水平，并且從行為學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)來看，兩者干預(yù)效果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但**組高架十字迷宮測試中直立次數(shù)的增多均較對(duì)照組更明顯，且**組體重情況優(yōu)于對(duì)照組，因此認(rèn)為疏肝清熱健脾法具有與丁螺環(huán)酮同等的抗焦慮效果，且在大鼠綜合體質(zhì)及精神狀態(tài)改善方面優(yōu)于丁螺環(huán)酮。李寧等以不確定性空瓶刺激建立 GAD 模型，并以丹梔逍遙散進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示丹梔逍遙散抗焦慮效果優(yōu)于丁螺環(huán)酮，與本研究結(jié)果有異，考慮可能與模型應(yīng)激方式不同有關(guān)，另也應(yīng)與丁螺環(huán)酮的給藥天數(shù)不同而致起效不同有關(guān)。

概言之，通過環(huán)境相關(guān)恐懼應(yīng)激的方法建立模型，可以造成大鼠明顯的焦慮狀態(tài)，雖然條件性訓(xùn)練階段電擊對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有軀體刺激，但在環(huán)境相關(guān)恐懼刺激階段及改變的環(huán)境信息階段均避免軀體應(yīng)激成分，而且環(huán)境信息的不確定性有利于引發(fā)動(dòng)物情緒泛化，易于產(chǎn)生彌散而持續(xù)的焦慮，因而較好地模擬GAD 的發(fā)病狀態(tài)。疏肝清熱健脾法與丁螺環(huán)酮在行為學(xué)上均表現(xiàn)出肯定的抗焦慮效果，前者在動(dòng)物整體體質(zhì)狀態(tài)改善方面效果更優(yōu)。但該模型作為 GAD 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型具體的神經(jīng)病理改變?nèi)杂写剿?，中藥的作用機(jī)制亦有待更深入的研究。