大小鼠條件恐懼實(shí)驗(yàn)方法

（Fear Conditions test）

一.實(shí)驗(yàn)原理

條件性恐懼實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（場景恐懼系統(tǒng)）用于小型嚙齒類動(dòng)物（大、小鼠）環(huán)境相關(guān)條件性恐懼實(shí)驗(yàn)研究。嚙齒類動(dòng)物在恐懼時(shí)會(huì)表現(xiàn)出特有的不動(dòng)狀態(tài)（Freezing），動(dòng)物在這種情況下傾向于保持靜止不動(dòng)的防御姿勢(shì)。抗抑郁藥和抗**興奮藥可以明顯縮短不動(dòng)狀態(tài)持續(xù)的時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)對(duì)象被給與一個(gè)聲音信號(hào)（條件刺激），隨后給予電擊（非條件）刺激。該訓(xùn)練稱為條件性訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行聲音信號(hào)或環(huán)境聯(lián)系性實(shí)驗(yàn)。一般情況下嚙齒類動(dòng)物對(duì)相應(yīng)的環(huán)境和不同環(huán)境下同樣的聲音信號(hào)都會(huì)做出明顯的條件性恐懼反應(yīng)，如僵直靜止不動(dòng)。這種測試可以在訓(xùn)練結(jié)束后立刻或幾天后進(jìn)行可以提供在條件信號(hào)影響下短期和長期記憶的信息。

二.實(shí)驗(yàn)裝置

恐懼箱材質(zhì)采用無味的ABS塑料材質(zhì)或者醫(yī)用有機(jī)板，顏色為黑色或者灰色。上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)的恐懼系統(tǒng)包括一個(gè)30cm*30cm，底部可通電的實(shí)驗(yàn)箱、一個(gè)直徑為5cm/10cm 的平臺(tái)、隔音箱（內(nèi)附吸音棉）以及SuperFcs條件恐懼視頻分析軟件，通常平臺(tái)高度與直徑一樣，尺寸可定制。實(shí)驗(yàn)箱上方安裝錄像監(jiān)控器（視頻盒），以錄制動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)箱中的活動(dòng)情況，以供日后分析使用。

三.實(shí)驗(yàn)方法

A方案

1. 在實(shí)驗(yàn)前一個(gè)星期，每天撫摸實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1-5min，連續(xù)7天，（這個(gè)時(shí)間段需要實(shí)驗(yàn)員根據(jù)實(shí)際情況來定制）借以消除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)實(shí)驗(yàn)者的恐懼。

2. 訓(xùn)練期：訓(xùn)練時(shí)將動(dòng)物放入恐懼箱內(nèi)適應(yīng)3min，然后給予聲光刺激（持續(xù)30s，70db，3000Hz）和底部**通交流電（持續(xù)2s，0.5mA），結(jié)束后停留30s，將動(dòng)物再放回飼養(yǎng)籠。

3. 測試期：將動(dòng)物重新放回實(shí)驗(yàn)箱，不給予任何刺激，記錄動(dòng)物5min內(nèi)僵直反應(yīng)時(shí)間（除呼吸運(yùn)動(dòng)外無其他任何行為活動(dòng)的狀態(tài)）。測試后2h，進(jìn)行改變環(huán)境（實(shí)驗(yàn)箱放入分隔板、側(cè)壁換成斑馬紋板或者壁上貼上其他形狀物體）的條件性（無聲音180s；聲音180s，70db，3000Hz）恐懼測試。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用酒精檫拭場地，避免氣味干擾。

B方案

將大鼠放在動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)適應(yīng)一周。飼養(yǎng)室內(nèi)溫度為24±0.5℃，濕度為60%，光：暗周期為12h：12h（光照時(shí)間為8：00-20：00），隨機(jī)分籠單獨(dú)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

（1）條件性恐懼的建立：將大鼠分別放入斯金納箱（箱子底部為銅條柵欄，可通電）內(nèi),適應(yīng)2分鐘后再給予單一頻率聲音信號(hào)(4.5KHZ,60dB,30S，該聲音由美國Adobe公司的Adobe Audition2.0軟件制作)適應(yīng)4次（兩次聲音間隔1-4分鐘）,然后再給予6次以聲音信號(hào)為提示的不可逃避足底電擊(1mA,5s)，聲音與電擊同時(shí)結(jié)束，兩次聲音間隔為1-4分鐘，共28分鐘。動(dòng)物在被電擊時(shí)發(fā)生驚叫、驚跳、逃避等,聽到聲音提示時(shí)出現(xiàn)慌張、逃避或者僵立行為（除呼吸外無其他運(yùn)動(dòng)行為），這樣建成恐懼動(dòng)物模型（以下簡稱建模）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后讓動(dòng)物在斯金納箱內(nèi)繼續(xù)停留2分鐘后放回飼養(yǎng)籠飼養(yǎng)。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用90%酒精擦拭箱底，用濕布擦拭箱壁，以避免殘留氣味對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)大鼠的影響。

（2）恐懼消退訓(xùn)練：24h后將已經(jīng)建立條件性恐懼的動(dòng)物再次放入斯金納箱內(nèi)，僅給予聲音信號(hào)16次，兩次聲音間隔為1-2分鐘，共24分鐘。恐懼對(duì)照組在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)放進(jìn)斯金納箱內(nèi)24分鐘，不進(jìn)行消退訓(xùn)練（不給聲音刺激）。 (3)條件性恐懼消退保持測試：恐懼對(duì)照組和恐懼消退組（注：此時(shí)大鼠分為兩組：恐懼消退組和對(duì)照組）分別在恐懼消退訓(xùn)練后的第1、3、7天將大鼠放在訓(xùn)練箱內(nèi)，給予5次聲音信號(hào)，時(shí)間間隔為0.5s，記錄3分鐘內(nèi)的不僵立時(shí)間，計(jì)算3分鐘內(nèi)不僵立時(shí)間百分比，作為消退保持成績。百分比越高，表明消退保持成績?cè)胶谩?

<備注>：實(shí)驗(yàn)方法摘錄相關(guān)文獻(xiàn)，僅供參考使用。

四.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

主要應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：                        

1.Freezing次數(shù)，動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)箱中前后一共出現(xiàn)的僵直次數(shù)                         

2.Freezing時(shí)間，實(shí)驗(yàn)開始后動(dòng)物一共出現(xiàn)僵直行為的總時(shí)間

這2個(gè)指標(biāo)作為評(píng)價(jià)動(dòng)物恐懼記憶的重要指標(biāo)，通常這兩個(gè)指標(biāo)高度相關(guān)。

五.注意事項(xiàng)

1. 實(shí)驗(yàn)前一周每天撫摸大鼠可以明顯減少大鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)者的恐懼感以及無關(guān)刺激對(duì)實(shí)驗(yàn)箱中動(dòng)物的影響。

2. 盡管還沒有證據(jù)證實(shí)在**中不同時(shí)間對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否有明顯的影響。但是結(jié)合實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)建議實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測時(shí)間*好在上午9:00至下午15:00之間進(jìn)行，如果有條件，且需要重復(fù)多次檢測，盡量在每天同一時(shí)間段檢測，以減少數(shù)據(jù)的波動(dòng)。

3. 每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用酒精檫拭場地，避免氣味干擾。

4. 動(dòng)物的回避性反應(yīng)差異較大，因此需要檢測大量的動(dòng)物。如需減少差異或少用動(dòng)物，可對(duì)動(dòng)物進(jìn)行預(yù)選或按學(xué)習(xí)成績好壞分檔次進(jìn)行試驗(yàn)。

5. 電流刺激大小需要根據(jù)每批次動(dòng)物的應(yīng)激情況來調(diào)節(jié)，通常小鼠刺激大小為0.2-0.5ma，大鼠為0.6-0.9ma左右。

6. 隔音箱的作用是*大限度的降低外界噪音、光線以及人為因素對(duì)實(shí)驗(yàn)本身的干擾，隔音箱屬于選配組件，情況允許下建議配置。